Tema 4. Metabolismo y nutrición bacterianos.
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METABOLISMO:

Es la suma de todos los procesos químicos que ocurren en un organismo.
- Catabolismo: conjunto de procesos químicos celulares que liberan energía.
- Anabolismo: conjunto de procesos químicos celulares que utilizan energía.

Una ruta metabólica es una secuencia de reacciones químicas intracelulares catalizadas por enzimas.
Las rutas metabólicas son determinadas por enzimas.
Los enzimas son codificados por los genes.

CATABOLISMO BACTERIANO:

- Fases:
- Quimiotaxis: algunas bacterias que son móviles. Para capturar una cosa que necesita una bacteria Ej. Proteína. Lo hace mediante movimientos que es la quimiotaxis: es el desplazamiento a favor de un gradiente químico

- Digestión: las bacterias segregan enzimas al exterior para degradar macromoléculas que están en el exterior.

- Absorción:
- difusión simple
- difusión por osmosis Ej. agua
- transporte asociado a permeasas hacen:
- difusión facilitada
- transporte con consumo energético (transporte activo)
- translocación de grupo (fosforilación)

- Preparación: endoenzimas de las rutas catabólicas.

- Oxidación biológica: se obtienen un rendimiento energético que permite hacer otras reacciones. Consiste en la separación de una molécula. Es la síntesis de ATP que se hace mediante:
- fosforilación a nivel del sustrato
- fosforilación oxidativa

TIPOS DE GENERACION DE ENERGIA:

- Respiración aerobia: con la cadena de transporte de electrones el aceptor final de electrones es el oxígeno.

- Respiración anaerobia: en la cadena de transporte de electrones el aceptor final de elementos no es el oxígeno molecular.
Se obtiene menos energía que en la respiración aerobia debido a que solo parte del ciclo de Krebs, funciona bajo condiciones anaerobias

- Fermentación: Independiente de la respiración (no necesita cadena respiratoria). Existen varias rutas fermentativas y en todas ellas el número de moléculas de ATP sintetizadas es menor que el obtenido mediante la respiración.

CARACTERISTICAS DE LA RESPIRACION:

- fosforilación oxidativa ( ATP + P + Eà ATP)
- Requieren una cadena de transporte de electrones
- Pueden ocurrir en presencia de oxígeno (respiración aeróbica) o en su ausencia (respiración anaeróbica).
- Tiene como aceptor final de electrones un compuesto inorgánico

RESPIRACION AEROBICA:

- El aceptor de electrones es el oxígeno.
- Utiliza la cadena de transporte de electrones para generar un gradiente de protones imprescindible para que las ATPsintasas formen ATP.

RESPIRACION ANAEROBICA:

Existen bacterias que utilizan aceptores de electrones distintos al oxígeno.

Aceptor de electrones Productos
NO3- NO2+, N2 + H2O
SO4- H2S + H2O
CO3- CH4 + H2O


Ruta Eucariotas Procariotas
Glucolisis citoplasma citoplasma
R. intermedias citoplasma citoplasma
C. de Krebs matriz de mitocondria citoplasma
CTE matriz de mitocondria mb. Plasmatica

FERMENTACION:

- Características:
- fosforilación a nivel de sustrato (citoplasma)
- no necesita cadena de transporte de electrones (CTE)
- utiliza como aceptor final de electrones una molécula orgánica.
- El ATP se forma por donación de ATP de un fosfato de alta energía a partir de un producto intermedio fosforilado.


GLUCOLISIS:

Glucosa --à Ac. Piruvico + 2ATO + 2NADH



RUTAS FERMENTATIVAS:

- Fermentación Homolactica, Ej. Estreptococos, lactobacilos
Ac. Piruvico-à Ac. Láctico
- Alcohólica, Ej. Levaduras
Ac. Pirúvico -à Ac etílico
- Ácido-mixta, Ej., E. coli, algunas enterobacterias
Ac. Pirúvicoà Ac láctico, acetifico, H2 + CO2 + Ac succinico, etanol
- Butilenglicolina, Ej. Pseudomona
Ac Pirúvico 2´3 butilenglicol
- F. del ácido propionico, Ej. Propionibacterium
Ac. Pirúvico a 2 Ac propionico

Indicador de pH: rojo fenol
pH neutro- alcalino: color rojo
pH ácido: color amarillo



CATABOLISMO DE LAS PROTEINAS:

Proteína

proteasas extracelulares--à aminoácidos---deaminacion, decarboxilacion, dehidrogenacion--à Ac orgánico --à ciclo de krebs

CRECIMIENTO DE LAS POBLACIONES BACTERIANAS:

- Crecimiento bacteriano; incremento del número de células.
- células viables: células activas metabólicamente que pueden dividirse.
- Tiempo de generación: tiempo necesario para que una población duplique el número de células.
- Tasa o velocidad de crecimiento específica: aumento proporcional del número de células viables a lo largo del tiempo.
- Curva de crecimiento: cinética o comportamiento de un cultivo bacteriano respecto a su crecimiento.

MEDIDA DEL CRECIMIENTO BACTERIANO:

1) Cambio en el número de células:
A) contaje directo:
- Recuento en cámara: poco utilizable sobretodo para levaduras.
- fácil, barato, y rápido
- se usa para procariotas y eucariotas


- Contadores electrónicos:
- suspensión microbiana forzada a pasar por un origen pequeño.
- el paso de la bacteria por el orificio interrumpe la corriente eléctrica que fluye a través del orificio.
- se cuenta el numero de veces que se interrumpe la corriente, se cuentan las bacterias vivas y muertas.
- recuento sobre filtros de membrana:
- filtración de una muestra a través de membranas especiales con poros uniformes
- tinción de células o cultivos filtrado con placa
- se utiliza habitulamenete para muestreo de aire y agua.
B) Contaje de células viables:
- recuento en placa:
- determina el numero de células viables.
- tamaño d la población se expresa con unidades formadoras de colonias ( UFM / ML)
- esta técnica también esta utilizada para obtener colonias aisladas ( técnica de aislamiento por dilución en placa)

C + A = cuenta + aísla

Plaqueo de diluciones sobre un medio de cultivo
Contaje de nuecero de colonias
Calculo de número de células viables en la población
- métodos de filtración en membrana


2)Cambio en el incremento de la masa celular
- peso seco
- cantidad de un constituyente celular, Ej. Proteína, DNA, ATP
- medidas turbidometricas ( light scatetering)
- espectrometría
- turbidometria, nefelometría

MEDIOS DE CULTIVO BACTERIOLOGICO:

- Medios de cultivo: solución liquida o solidificada que contiene todos los nutrientes necesarios para permitir el crecimiento bacteriano. Una vez preparados deben ser esterilizados.

- Cultivo microbiano: Conjunto de microorganismos obtenidos en un medio de cultivo.

- Agar: polisacárido complejo que en suspensión liquida funde a 100ºC y solidifica a 40ºC adoptando la forma de recipiente Ej. Placa de Petri
- El agar no es degradado ni utilizado como nutriente por los microorganismos
- El agar es utilizado para obtención de medios sólidos (1,5 – 2%) y semisólidos ( 0,5%)
Las bacterias crecen de distinta manera según lo hagan en líquidos o en superficies sólidas:
Medios líquidos - crecimiento placktonico (bacterias en suspensión en el medio líquido).
Superficie – crecimiento formando biopelículas (biofilms). Ej. la placa dental es una biopelícula.

CLASIFICACION MEDIOS DE CULTIVO:

- según contenido:
- sintéticos o definidos: conocimiento de la composición química. Los componentes que lo integran y su cantidad son también conocidos.
- no sintéticos: no se conoce la composición exacta Ej. Agar cerebro – corazón

- según su estado:
- líquidos (caldo de cultivo), usos: obtención de masa bacteriana, etc..
- semisólidos: agar o gelatina (<1%) usos: motilidad, transporte
- sólidos (1´5-2%) usos: aislamiento, test sensibilidad o antibiótico

- según su utilización
- básicos: crecimiento de la mayoría de las bacterias cultivables
- enriquecidos básicos suplementos o sustancias nutritivas Ej. sangre – suero
- selectivos: crecimiento de alunas especies bacterianas e inhibe otras
- diferenciales: difencian las características bioquímicas de una especie bacteriana identificada

TIPOS DE TRANSPORTE:

Medios sólidos o líquidos que mantiene la viabilidad temporal de los microorganismos presentes en una muestra clínica sin inhibir, ni favorecer el crecimiento de algunas especies.

- no contiene elementos nutritivos o solo indispensables ( pre-reductores)
- condiciones físico-químicas oprimas solo para la supervivencia
- finalidad es la preservación de la proporción de microorganismo de la muestra (lugar de infección)
- para transporte de una muestra clínica al laboratorio

En las muestras clínicas microorganismos hay otras especies bacterianas además del patógeno responsable de la infección, la mayoría pertenecen a la microbiota.

El microbiólogo debe reconocer cual de esas especies es la causante de la infección mediante el uso de diversas técnicas.

CULTIVO DE MICROORGANISMOS:

-Siempre el medio de cultivo
- inoculo microbiano: número indeterminado de microorganismos introducido en medio de cultivo.
- cultivo puro: obtención de una población de microorganismos procedentes de una sola célula viable.
- contiene solo una especio o una cepa
- en medios sólidos obtenemos colonias aisladas que proviene de una unidad formadora de colonias (UFC) o células viables.
- colonia = clon
- técnicas para la obtención de un cultivo puro:
- aislamiento en placa:
- por estría
- por dilución

CONDICIONES DE CULTIVO:

- temperatura:
-habitualmente 36ºC, se utiliza incubadora o estufa de cultivo
- atmósfera:
- según el tipo de respiración de microorganismos
- cultivos en anaerobiosis o aerobiosis ( con o sin O2)
- presión osmótica:
- los medios de cultivo contienen NACL
-humedad:
- favorece el crecimiento en medios sólidos
-pH:
- se ajusta el pH del medio de cultivo, próximo a 7.

CULTIVO ANAEROBIOS, MEDIOS REDUCIDOS:

- medios reducidos
- obtenidos por la indusion de elementos que se combinan cn el O2 ( triglicolato - oxyrase)
- obtenidos por cantamiento que elimina el gas atmosférico de la masa liquida
Se pueden incluir un indicador químico de ausencia de O2.

  • JARRA DE ANEROBIOSIS
- cierre hermético
- ambiente sin O2 conseguido mediante compuestos reactivos cn el O2.
  • CÁMARA DE ANAEROBIOS
-cabina cerrada que permite la manipulación de los cultivos
- atmósfera formada por una mezcla de gases N2(85%), CO2(5%), H2(10%)
- utilizada para la manipulación y cultivo de anaerobios a una temperatura óptima para su crecimiento.

CAPNOFILOS:

-capnofilos; necesitan CO2 (5%) para crecer en los medios de cultivo
- generación de atmósfera de CO2 mediante:
- una vela que elimine O2 y genere CO2
- kit que incluye un generador de O2.

La cinética de crecimiento microbiano constituye una de las operaciones más utilizadas por la ingeniería alimentaria y la biotecnología, por lo tanto, es menester conocer los diferentes mecanismos de crecimiento, así como, la forma de cuantificación de los mismos, sus formas de aplicación, las ventajas y desventajas de los diferentes métodos, y sobre todo el monto económico de cada uno de ellos. Por tanto, el siguiente documento trata de proporcionar una información general acerca de los diferentes mecanismos de reproducción bacteriana, así como de dar una idea acerca de la utilización de los mismos, sus características, especificaciones, y un análisis de las ventajas y desventajas de cada uno de ellos.


CRECIMIENTO MICROBIANO:
"El crecimiento de células, microorganismos, células vegetales y animales, puede mirarse bajo dos aspectos o tipos de crecimiento reproductivo.
  1. Células individuales o población de células en crecimiento sincronizado para estudio del ciclo de vida celular. Procesos en laboratorio.
  2. División estocástica de la población, o división al azar.
La división celular se efectúa luego de un aumento en el tamaño de la célula, duplicación del núcleo, división celular, división citoplasmática (salva los organismos cenóticos). De ésta manera una célula da nacimiento a dos células hijas de tamaño idéntico y conteniendo los mismos elementos estructurales y potencialidades.
En el caso de las levaduras, y otros microorganismos, se presenta una variante que es ka gemación o botón. Se forma una pequeña protuberancia que aumenta progresivamente de tamaño, luego se produce la división en el núcleo y migra hacia el botón. Finalmente crece hasta un tamaño suficiente y posteriormente se separa formando otra célula idéntica a la madre. Las células hijas, sin importar el procedimiento de división celular, deben heredar todo el potencial genético y son idénticas."
MEDICIÓN DEL CRECIMIENTO MICROBIANO:
El cálculo del número de células que existen en una suspensión se puede llevar a cabo mediante el recuento celular (microscopía, número de colonias), masa celular (peso seco, medida del nitrógeno celular, turbidimetría) o actividad celular (grado de actividad bioquímica con relación al tamaño de la población). Todos estos métodos se clasifican en dos apartados: métodos directos y métodos indirectos.
Métodos directos:
  • Recuento del número de células en una cámara Thoma
  • Peso seco celular
  • Determinación de nitrógeno o de proteínas totales
  • Determinación de DNA
Métodos indirectos:
  • Recuento de colonias en placa
  • Recuento sobre filtro de membrana
  • Consumo de oxígeno
  • Liberación de dióxido de carbono
  • Concentración de un enzima constitutivo
  • Decoloración de un colorante
  • Incorporación de precursores radiactivos
  • Medida de la turbidez

CURVA DE LA CINÉTICA BACTERIANA

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Participaron: Paloma Díaz Freire (2006-07)
Jaime Casal Álvarez (2011-2012)